Optimasi Western Blot Protein Dengue Rekombinan NS1 pada Escherichia coli Strain BL21 Star (DE3) menggunakan serum DS033/06/Plasma II dan Anti-His(C-term)-HRP

Haritsyah, Lindi Grahawanti (2008) Optimasi Western Blot Protein Dengue Rekombinan NS1 pada Escherichia coli Strain BL21 Star (DE3) menggunakan serum DS033/06/Plasma II dan Anti-His(C-term)-HRP. Diploma thesis, Universitas Al Azhar Indonesia.

Text (UAI) - Published Version Available under License Creative Commons Attribution Non-commercial. Download (0B)

Abstract

Demam Berdarah Dengue (DBD) adalah penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus dengue dan ditularkan melalui gigitan nyamuk Aedes Aegypti. Kesalahan diagnosis atau kurang cepatnya diagnosis terhadap penyakir ini seringkali terjadi sehingga menyebabkan tingginya angka kematian. Oleh karena itu sangat penting untuk mendiagnosis DBD dengan cepat dan tepat. Pada penelitian ini dilakukan analisa ekspresi protein rekombinan dengue NS1 oleh Escherichia coli strain BL21 Star (DE3) yang mengandung plasmid pET-21d(+)-NS1 melalui teknik western blot. Dalam jangka panjang, diharapkan protein rekombinan yang dihasilkan dapat bermanfaat sebagai bahan untuk pembuatan alat diagnostik penyakit dengue. Vektor rekombinan pET-21d(+)-NS1 yang sebelumnya telah diverifikasi melalui sekuensing ditransformasikan ke dalam E.coli BL21 Star (DE3) dengan metode kejutan panas dan penyeleksian transforman dengan menggunakan penapisan ampisilin. Hasil plasmis transforman kemudian diisolasi dengan metode lisis alkalin. Verifikasi hasil isolasi vektor rekombinan pET-21d(+)-NS1 dilakukan dengan metode digesti menggunakan enzim restriksi BamH I dan Xho I. Selanjutnya, ekspresi protein rekombinan diinduksi dengan penambahan IPTG dengan konsentrasi akhir 1 mM dalam kurun waktu 0, 1, 2, dan 3 jam. Ekstrak protein yang diperoleh melalui sonikasi ditentukan konsentrasi proteinnya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 280 nm. Elektroforesis protein dilakukan dengan SDS-PAGE pada sistem buffer discontinuous. Optimasi SDS-PAGE dilakukan dengan tegangan dan waktu yang berbeda, sedangkan optimasi transfer protein dari gel ke membran dilakukan pada tegangan, waktu, dan dua jenis membran yang berbeda (PVDF dan nitroselulosa). Optimasi pada proses imunodeteksi menggunakan serum DS033/06/Plasma II dan Anti-His(C-term)-HRP dilakukan pada variasi konsentrasi pengenceran antibodi yang berbeda. Berdasarkan hasil optimasi didapatkan tegangan listrik dan waktu optimum untuk elektroforesis gel poliakrilamid, yaitu pada 150 Volt selama 50 sampai 65 menit. Waktu optimum yang didapatkan untuk transfer protein adalah selama 90 menit dengan tegangan 75 atau 80 volt pada membran nitroselulosa. Western blot dengan antibodi primer berupa serum DS033/06/Plasma II dengan konsentrasi pengenceran 1:1000 dan antibodi sekunder berupa Human IgG HRP conjugated dengan konsentrasi pengenceran 1:10000 memiliki background minimal. Selanjutnya western blot dengan pengenceran antibodi sekunder 1:10000 dan antibodi primer 1:5000, 1:7500, dan 1:10000 menunjukkan bahwa protein dengue rekombinan NS1 yang dieskpresikan pada Eschericia coli BL21 Star (DE3) dalam ekstraksi protein total tidak terdeteksi secara spesifik oleh serum DS033/06/Plasma II sebagai antibodi primer. Western blot dengan menggunakan Anti-His(C-term)-HRP sebagai antibodi primer pada konsentrasi pengenceran sebesar 1:5000 menunjukkan bahwa Escherichia coli BL21 Star (DE3) yang mengandung vektor pET-21D(+)-NS1 mengekspresikan protein rekombinan dalam bentuk protein fusi His6-NS1.

Actions (login required)

View Item